3/1:20822
2.8.22. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОХРАТОКСИНА А
ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ. Охратоксин А относится к нефротоксичным и
нефроканцерогенным веществам. По возможности все манипуляции проводят в вытяжном
шкафу. Вследствие электростатических свойств токсинов в сухом виде и их склонности к
распространению по всей рабочей поверхности, при работе с ними принимают особые меры
предосторожности, например, используют закрытый бокс, оборудованный перчатками-
манипуляторами. Посуда, контактировавшая с охратоксином А, должна быть
обеззаражена (например, посуду ополаскивают метанолом и обеззараживают, выдерживая
не менее 2 ч в растворе натрия гипохлорита концентрированном Р, после чего тщательно
промывают водой).
Лекарственное растительное сырье, подверженное контаминации охратоксином А,
проверяют с помощью валидированной методики. Описанная ниже методика приводится
в качестве примера, пригодность которой была доказана для оценки корней и экстракта
солодки. Для определения охратоксина A в лекарственном растительном сырье или
растительной фармацевтической субстанции можно использовать данную методику, если
доказана ее пригодность, или используют другую валидированную методику.
МЕТОДИКА
Жидкостная хроматография (2.2.29).
Используют стеклянную посуду из коричневого стекла, не содержащую остатков
детергентов. При необходимости перед использованием посуду промывают 10 % (об/об)
раствором серной кислоты Р и затем осторожно промывают водой дистиллированной Р
до полного отсутствия следов кислоты (проверяют с помощью индикаторных полосок
для определения pH).
Раствор А. Смешивают 80 объемов воды Р, предварительно доведенной муравьиной
кислотой безводной Р до значения рН 2,3, и 20 объемов ацетонитрила Р.
Испытуемый раствор. Используют иммуноаффинную колонку, содержащую антитела к
охратоксину А, с емкостью не менее 100 нг охратоксина А и обеспечивающую
открываемость (выход) не менее 70 %. К 2.00 г измельченного испытуемого образца (250)
(2.9.12) прибавляют 80 мл раствора 30 г/л натрия гидрокарбоната Р и экстрагируют при
воздействии ультразвука в течение 30 мин (через 15 мин сменяют воду в ультразвуковой
бане). Охлаждают до температуры от 15 °C до 25 °C, доводят до объема 100.0 мл (V
1
)
раствором 30 г/л натрия гидрокарбоната Р и центрифугируют. 5.0 мл (V
i
) прозрачной
надосадочной жидкости тщательно перемешивают с 30 мл буферного раствора с рН 7.4 Р
и весь полученный объем пропускают через иммуноаффинную колонку, имеющую
температуру от 15 °C до 25 °C, со скоростью 3 мл/мин (скорость не должна превышать
5 мл/мин). Колонку промывают 10 мл буферного раствора с рН 7.4 Р, затем дважды
промывают водой Р порциями по 10 мл со скоростью, не превышающей 5 мл/мин, и
высушивают с использованием слабого вакуума в течение 5 – 10 с или пропусканием
через колонку воздуха с использованием шприца в течение 10 с. В колонку вносят 0.5 мл
метанола Р и дают растворителю пройти через колонку под действием силы тяжести.
Элюат собирают в стеклянный флакон вместимостью 4 мл. Через 30 с в колонку вносят
вторую порцию 0.5 мл метанола Р, дают растворителю пройти через колонку под
действием силы тяжести и собирают в тот же стеклянный флакон. Через последующие
30 с вносят третью порцию 0.5 мл метанола Р. Собирают весь удерживаемый в колонке
объем, пропуская через нее воздух или при помощи вакуума. Объединенные элюаты
выпаривают досуха в среде азота с использованием нагревательного блока при
температуре 40 °С. Сухой остаток растворяют в 0.5 мл (V
2
) раствора А. Если полученный
раствор прозрачный, он может быть использован для дальнейшего испытания. В случае
получения непрозрачного раствора, его пропускают через мембранный фильтр (например,
политетрафторэтиленовый фильтр с размером пор 0.45 мкм), который не удерживает
охратоксин А.
Первичный основной раствор охратоксина А. 1.0 мл раствора охратоксина А Р доводят
метанолом Р до объема 100.0 мл и тщательно перемешивают.
Вторичный основной раствор охратоксина А. 10.0 мл первичного основного раствора
охратоксина А доводят метанолом Р до объема 100.0 мл и тщательно перемешивают.
Стандартные растворы охратоксина А. Объемы первичного основного раствора
охратоксина А или вторичного основного раствора охратоксина А, указанные в таблице
2.8.22.-1, помещают в отдельные колбы и доводят раствором А до объема 50.0 мл.
Таблица 2.8.22.-1 – Стандартные растворы охратоксина А
Стандартный
раствор
Объем первичного основного
раствора охратоксина А
(мкл)
Конечная концентрация
охратоксина А в стандартном
растворе (нг/мл)
1
5000
50
2
2500
25
3
1000
10
4
500
5
5
250
2.5
Стандартный
раствор
Объем вторичного основного
раствора охратоксина А
(мкл)
Конечная концентрация
охратоксина А в стандартном
растворе (нг/мл)
6
500
0.5
7
100
0.1
Калибровочная кривая. Строят калибровочный график зависимости сигнала от
концентрации охратоксина А (в нанограммах на миллилитр) в стандартных растворах 1 –
7 (охватывает диапазон, эквивалентный содержанию охратоксина А в испытуемом
образце от 0.5 ppb до 250 ppb) и проверяют его линейность. Если содержание охратоксина
А в испытуемом образце выходит за пределы калибровочного диапазона, испытуемый
раствор должен быть разведен до достижения подходящей концентрации.
Условия хроматографирования:
– колонка: длиной 0.15 м и внутренним диаметром 4.6 мм, заполненная силикагелем
октадецилсилильным для хроматографии Р с размером частиц 5 мкм;
– температура колонки: 45 °С;
– подвижные фазы:
– подвижная фаза A: вода Р, доведенная кислотой фосфорной Р до рН 2.3;
– подвижная фаза В: ацетонитрил Р;
– режим градиентного элюирования:
Время
(мин)
Подвижная
фаза А
(%, об/об)
Подвижная
фаза В
(%, об/об)
0 – 30
80 → 40
20 → 60
30 – 35
40 → 20
60 → 80
35 – 37
20
80
37 – 40
20 → 80
80 → 20
‒ скорость потока 0.8 мл/мин;
‒детектор: флуоресцентный; рекомендуемые настройки – 330 нм (длина волны
возбуждения) и 460 нм (длина волны эмиссии);
– объем вводимой пробы: 20 мкл.
Расчеты. Рассчитывают уравнение линейной зависимости вида y=ax+b. Концентрация
охратоксина А в испытуемом растворе равна
, где S – измеренный сигнал для
испытуемого раствора.
Содержание охратоксина А в испытуемом образце (в ppb) рассчитывают по формуле:
где:
m
–
навеска испытуемого образца, взятая для анализа, в граммах;
V
1
–
объем полученного экстракта в миллилитрах;
V
i
–
объем раствора, взятый для иммуноаффинной очистки, в миллилитрах;
V
2
–
объем раствора, в котором был растворен сухой остаток, в миллилитрах;
С
–
найденная концентрация охратоксина А в испытуемом растворе в
нанограммах на миллилитр.
